一株苯酚降解菌的分离和鉴定

　　环境科学学报株苯酚降解菌的分离和鉴定徐玉泉张维欠陈明3，林敏3李浚明2，方宣钧。中国农科院生物技术研，所，北京100086；2.中国农业大学生物学院，北京94；3.中国农科院原子能利用研宄所，北京*高苯酸降解率为394llmoレmg.min.经Biolog细菌自动鉴定，鉴定，该菌株为醋酸钙不动杆菌jc，2e必JCerrac，a采用10扩增获得的该菌163出，片段，核苷酸序列分析结果明，该菌株的163山队的核苷酸序列与醋酸丐不动杆菌同源性为98.在细菌系统发育分类学上，1出=2归属变形细菌7亚类不动杆菌属醋酸妈不动杆菌。

　　笨酚是造纸炼焦炼油朔料纺织等工业废水中的主要污染物。美国环保署把苯酚列入优先污染物和65种有毒污染物名氧我国也把苯酚列入中国环境优先污染物，ブ，雄。

　　清除工业废水中酚的方法包括微生物降解萃取活性炭吸附和化学氧化等，其中利用微生物降解是种经济有效且无第次污染的方法。国内外学者对如何利用微生物清除废水中的酚及其衍生物进行了大量研究2本研宄从某炼油厂排出的废水中分离到株高效降解苯酚的菌株。并利叫，8细菌动鉴定仪及16 51印列分析法对其进疔鉴定。3，细菌自动鉴定仪主要根据被测菌的代谢指数与其数据库中的1500多种细菌鉴定信息进行比较来鉴定细菌。具开欠速准确叮1伽特性。代谢指数是被检测菌对，1板195种碳源的利叫能力，根据戈谢指数即娜趟种165.序列分析法是近十年来发展起来的种分子指纹技木广泛应用于分子系统发育分类学研究口。16 31人有很高的保守性，通过未知菌与姐大1库中己知种屈的6，序列作1源饮比较，可以鉴定到种的水14.

　　收稿日期19990719；修订日期1991030基金项目由国家高科技863计划资助作者简介徐玉泉197男，博士研究生通讯联系人4W除1泉等株苯酚降解菌的分离和砚定451高效苯酚降解菌株在采用环保微生物治理含酚工业废水污染中有巨大的应用潜力，该菌株的分离鉴定将为本研宄进步克隆与苯酚降解有关的基因和构建降解多种污染物的环保工程菌株奠定基础，具有理论和实际应用价值。

　　1材料与方法1.1样品及培养站废水样品取自东北某炼油厂。驯化培养基为含等比例邻氯苯对氯苯间苯酚和对苯酚混合底物终浓度为5，10的6固体培养基8蛋白胨，5酵母提取膏，10分离培养基为合苯酚的，15无机盐古体培养坫，4414131.1 4地，4415琼脂，0.5苯盼，加水到100，调至6.8，含苯酚的15尤机盐液体培养基不添加琼脂。

　　1.2刺；含量的测根据氨基哌比啉以本文改进的方法测笨酚的允量将掊诈液进厅扣。，离心10后，取上清100凡加入到10就的试管中，加蒸馏水到51！山加入100吒0.5 molL的NH4OH溶液，用pH6.8的磷酸缓液调lH到7.9左l.加50fL2的4氨基安替比啉混匀，再加入50叫8的铁氰化钾溶液，混勾，15，士1后，在5处测吸光度3苯酚降解菌降解效率的测定，按，1阻的厂沈1测定苯酚的降解率。蛋含谢安也，1的方法1测迫。以牛血清白蛋白为标准蛋白。，降解炼油厂废水中残留酚试验取1废水处理厂第级排水口中排出的废水放离心符，12000离心10上清液备用。将苯酚降解菌接种到含20，废水上清液的角瓶中，3020，连续振摇培养5同时以不接菌的废水上清液为对照。

　　1.4生理鉴定在8，1961平板上，除对照孔不含碳源夕，每孔都含有6杜320此0缓冲营养培养基和不同碳源，被鉴定的菌细胞悬浮在微孔中，培养241！后采用极，8细菌自动鉴定仪检狈供试菌株的代谢指数。

　　1.5细菌总认的提取用303蛋白酶裂解，十六烷基甲基溴化铵，人6沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醉沉淀提，总抓1.

　　1.7幻1扩，反应物纯化连接及转化用毛细管，0，扩增仪87进行扩增反应。体系总体积为20凡超纯水9.5物丁叫酶0.5外，总，稀释50倍后取2叫，吸入毛细管，封口。反应为35个循环，其环境科学学报20卷凝胶电泳，8染色后紫外分析仪检测。

　　用01063，人纯化试剂盒回收琼脂糖凝胶上的，广物，用，13 9，阽6387载体试剂盒进行连接，转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞，然后在含氨苄青霉素AP5μgmL1丁0，1的8平板上选择白斑，碱解法提取质粒，经，1酶切和电泳检测插入片断的大小。

　　1.816SrDNA的测序和同源性比较163人的测序由赛百盛生物工程公司如完成，将测序结果用入3丁软件与，6 81中的163人序列进行同源性比较12.

　　2结果与讨论2.1苯酚降解菌的分离与纯化污水样品经倍比稀释后涂在驯化培养基上，30，1夜培养，挑取单菌落驯化数次。从多次驯化的平板上挑取单菌落接种到含5，苯酚的分离培养基上，30，培养5，螅，芄，在其上生长的即为能以苯酚为单碳源和能源的菌株。暂将该苯酚降解菌株定名为，人2.

　　22菌株，1人2苯酚降解特性的研究挑取18平板上新活化的单菌落接种到2，的18液体培养基中，30，2，171摇床过夜培养至对数生长期6，值约为40.6，按2的比例分别接种到苯酸终浓度为0.2和0.5的1001的人15无机盐液体培养基中，以不接菌为对照。30，200 1条件下连续摇振培养。每隔12取5培养液测定，加，值。同时测苯酚的含量。结果明在液体无机盐培养基人15中，在含有0.24的苯酚浓度下，菌的生长迟滞期为12而在0.5mgmL的苯酚浓度下，菌的生长迟滞期为72h，说明苯酚浓度越高，菌的生长迟滞期越长1.从1中，人2的生长曲线进步可以看到，苯酚浓度越高，菌生长量越大，在0.21耶14的苯酚浓度下，菌生长的*大，6，值为166，而在0.5 1的苯酚浓度下，菌生长的*大，6，值为45明苯酚能被菌体利用，确实作为碳源供生长所需。在人2生长的迟滞期，苯酚浓度变化很小，而当菌体生长进入对数生长期后，苯酚浓度下降很快，明苯酉分的降解发生在对数生长期，并且在12内被完全降解。按，1801的方法测得苯酚的降解率为1963941.高于1等13所测的坟，0结果。废水上清液中接种苯酚降解菌约2，后，用氨替比啉法不能检测到残留苯酉分，而不接菌iMmn杂的炼油厂废水中具有高效降解苯酚的能力2温度对，1人2的生长和苯酚的降解有不同的影口向，在不同温度下培养16后，测定该菌在苯酚浓度为0.3mgmL的A15无机盐液体培养基中的菌体生长量证21.顺。1加均具有定的苯酉分降解能力。，人2生长及利用本酉分，在不同苯酚浓度下，人2的生长和降解曲线2具较广的1.旧适应范围。在1出510范围内均能在笨吩浓度为0.3的尤机盐液体培养坫良好生长培养该阐在阳今范围内对苯酚的降解率达1001.阳102的生长受到定的抑制。其苯酚降解率仅为48.7.为4或时，1人2的生长几乎完全被抑制。

　　24苯酚降解菌株的生理特性鉴定将1化2细胞公泞接种到95种，源的，1叩板微孔中，培养241后，测定2的代谢指数，1为，取人2对95种碳底物的利用能力。根据，人2的代谢指数，经细菌鉴定系统分析，2.属船酸钟+动杆殓上〃汉66纪。〃。相似率底物利用状况底物利用状况底物利用状况底物利用状况水羟基苯乙酸1蜜糖L组氨酸a环糊精衣康酸择甲基1葡糖苷羟基脯氨酸糊精a酮基丁酸D阿洛酮糖L亮氨酸糖元a酮基葡萄糖酸D棉子糖L鸟氨酸吐温40 a酮戊酸L鼠李糖L苯丙氨酸吐温80 D，L乳酸1山梨糖醇L脯氨酸以乙酰1半乳糖胺丙酸蔗糖L焦谷氨酸以乙酰1萄萄糖胺丙酸1海藻糖以丝氨酸糖醇奎宁酸土冉糖L丝氨酸L阿拉伯糖1糖精酸木糖醇L苏氨酸1阿拉伯糖醇癸酸甲基丙酮酸盐D，L肉毒碱纤维糖琥珀酸琥珀酸乙酯7氨基丁酸丁醇溴代丁酸乙酸尿刊酸果糖琥玻酰胺酸1阳乌头酸肌苷L岩藻糖葡萄糖酰胺柠檬酸尿苷D半乳糖丙氨酰胺甲酸胸腺嘧啶龙胆糖1丙氨酸D半乳糖酸内酯苯基乙胺，1葡萄糖L丙氨酸D半乳糖酸腐胺m肌醇L丙氨酰甘氨酸D葡萄糖酸2氨基乙醇心1乳糖L天冬酰胺D氨基葡萄糖酸Z3丁醇L天冬氨酸D葡萄糖醛酸甘油麦芽糖L谷氨酸心羟基丁酸D，Lcx甘油磷酸盐D甘露糖醇甘氨酸天冬氨酸3羟基丁酸葡萄糖1磷酸D甘露糖甘氨酰谷氨酸y羟基丁酸葡萄糖磷酸注十可利用，不能利用。有微弱利用能力25人2165人序列分析及其分子鉴定扩增，得到长约1.5，的，扩增产物。将其插到丁载体中。连接1扩增产物的丁载体经1酶切后。插片断被切为两个人小为662利1838的小片断如阁2.将获得131收，樘。立樘号为59045.

　　环境科学学报20卷增片断，3未插入16Sl，DNA的T载体，4插入16SrDNA的T载体，5瓦，只1酶切的未插入1681的丁载体，61酶切的插入16 8人的载体168从的扩增连接及，癖酶切结果用肌人3丁程序对1人2的163出财序列和，318中已登录的163冗人序列进行核苷酸同源性比较，结果发现与多株不动杆菌种属的16 3人核苷酸序列同源性均在90以上，与两株醋酸钙不动杆菌16 3江人序列的同源性高达98，人2在分子系统发育分类学上属于不动杆菌属，醋酸钙不动杆菌，与生理鉴定结果吻合。，人2与已报道的苯酚降解菌尸，办，肌8.060013和儿似如船版似，825，16同属变形细菌中的7亚类。

　　1.从炼油厂排出的废水中分离到株能以苯酚为唯碳源的菌株，人2，经8，1细，金走系统和1650，人，源性比较，该归属醋酸丐不动杆菌也7故加92放奶。

　　核苷酸序列3结论3.醋酸钙不动杆菌，1人2对苯酚的降解效率高于己报道的醋酸钙不动杆菌18825013.在成分复杂的炼油厂废水中保持高效降解苯酚的能力，具有很高的研宄和应用价值。

　　金相灿，等。有机化合物污染化学有毒有机物污染化学叫。北京清华大学出版社。1990.250265陈勇生，常晓青，等。对氯酚的生物降解及其污染土壤的生物修复探索。环境化学，1999，1818286陈文新。细菌系统发育。微生物学报，1998，38240243国家环保局水和废水监测分析方法编委会。水和废水监测分析方法。北京中国环境科学出版社。1997.

　　l4牛世全，胡正嘉。高效解酚细菌的筛选。环境科学与技术。19924447

(完)