杀菌通透性增加蛋白的细胞定位

　　杀菌通透性增加蛋白的细胞定位刘家云，于文彬，马越云，丁振若，苏明权，陈云春（第四军医大学西京医院检验科，陕西西安710033）中图号： R392. 11文献标识码： A体，为研究BPI在细胞内的定位奠定基础。方法分离人外周PM N）和单个核细胞， PMN， HL60及单个核细胞分别进行提取，逆转录PCR反应扩增BPI基因片段和免疫荧光法检测。结果逆转录PCR在PM N和HL60细胞中扩增出基因片段，活细胞免疫荧光染色观察到PMN和HL60能够与抗BPI的单抗所结合而呈阳性。结论BPI是中性粒系细胞的特异性产物。

　　0引言机体在抵御微生物侵袭的过程中嗜中性多形核核心环节， PMN内含众多的抗微生物物质，这些物质包括蛋白质、多肽以及氧依赖的自由基，病原微生物入侵时，所有的抗菌物质协同作用，导致入侵微生物的溶解破坏及清除， 20世纪80年代，人们逐步认识到阳离子多肽是吞噬细胞中非氧依赖的杀菌效应分子之一。几乎同一时期， Weiss等从健康人的中提取得到一种的蛋白质，因其对数株革兰阴性菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过细胞壁而进入菌体，因而称之为杀菌/通透性增加蛋白（ bac是由456个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功能，与革兰阴性力，同后者结合所形成的BPILPS复合物能抑制LPS的炎性级联信号向CD14的传导，从而阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应对血液中吞噬与非吞噬细胞的研究发现BPI主要存在于PM N中，除人外，还在兔、牛的PM N胞质颗粒中发现了BPI。为确定能产生BPI的细胞群体，以便更深入地研究其生物学功能奠定基础。本实验分离人外周血获得PM N和单个核细胞，后两者和HL60分别进行了RNA提取，逆转录PCR反应扩增基因片段及免疫荧光法染色。

　　1材料和方法1. 1材料人外周血来自健康体检者EDT A抗凝血髓样白血病细胞系HL60由本室保存，其培养基小牛血清，取对数增殖期细胞提取分离液购自产品荧光抗体羊抗鼠IgGFIT C， PCR marker购自华美公司小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。

　　1. 2方法引物的设计与合成运用计算机软件辅助分析，根据BPI基因编码序列，设计两套引物采用套式PCR扩增目的基因，其中外引物P1， P2扩增NA第25749 bp，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列设计如Fig 1.

　　1. 2. 2细胞分离与提取收集健康体检者EDTA抗凝血20 mL，取50 mL离心管加入等量Polymor分离液，小心地将全部抗凝血加至分离液层面上，室温下400～450 g离心40 min，离心后细胞分为3层，上层为单个核细胞（包括单核细胞和淋巴细胞） ，中层为PM N，下层为红细胞，分别吸出单个核细胞和PM N，稀释于等体积的4. 5 mL？L液，细胞悬液再用生理盐水洗涤3次，每次400 g， 10细胞记数。离心培养液500 g， 10 min收集HL 60细胞。

　　的提取参照Kit中的说明书进行，具体步骤：于1. 5 mL离心管中细胞，取1 mL T rizol试剂加于管中反复吹打，待核蛋白完全溶解室温下静置5 min，加0. 2 mL三氯甲烷，用力振荡15 s，室温下静置2～无水溶解，并置55℃水浴10 min，取2 LL用于反转录。

　　混LL，于42℃水浴反应1 h， 99℃5 min灭活逆转录酶后置 20℃备用。

　　扩增片段首先以反转录产物为模板进行第1轮PCR扩增，所用引物为P1的引物， Taq聚合4 LL，反应条件为：循环 72℃， 7 min共进行35个循环。之后以第1轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增，所用引物为P3及P4，反应体积同上，反应条件为： 94℃，min进行35个循环。 PCR产物的分析：取PCR产琼脂糖凝胶电泳（含0. 5 Lg？

　　溴化乙锭） ，以DNA分子量为标准，观察照相。

　　1. 2. 6BPI的间接免疫荧光染色用DM EM完全培养基调整HL60， PM N和单个核细胞为5×10取40 LL细胞悬液加入预先有BPI mAb正常兔血清， 4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次， 2羊抗鼠IgGFITC荧光二抗，充分振荡， 4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次， 2 mL？次固定液100 LL，制片后荧光显微镜下观察照相。

　　2结果2. 1RNA的完整性及纯度从HL60， PM N及单个核细胞中提取的总RNA经电泳，可见明显的28，条带（ Fig 2） ，且28 s的亮度大约是18 s的2倍，说明所提取的总RNA基本没有降解，有较好的完整性。对RNA样品进行紫外分光光度分析得出A反转录要求。

　　2. 2BPI基因的扩增反转录产物经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见一条约700 bp的扩增区带（ Fig 3） ，与预期的结果一致。

　　2. 3BPI免疫荧光染色活细胞免疫荧光染色观察发现， PMN和HL60免疫荧光染色发出较强荧光，单个核细胞内未见明显荧光，提示BPI存在于PMN和3讨论为确定含有BPI的血细胞， Weiss等将人外周血固定制片，与兔抗BPI结合，洗涤，再加荧光标记的猪抗兔IgG抗体，发现只有PM N细胞发出荧光，淋巴细胞、单核细胞、红细胞、血小板及嗜碱性粒细胞几乎没有荧光，而嗜酸性粒细胞发出很淡的荧光，难道说参与变态反应和寄生虫感染免疫应答反映的嗜酸性粒细胞也含有BPI运用蛋白印迹技术， Calafat等从PM N和嗜酸性粒细胞中检测出55×10的BPI，免疫电镜研究发现嗜酸性粒细胞中的成熟和不成熟特异性颗粒中均含有放射免疫对的定量测定发现外周血中酸性粒细胞中的检出表明这些细胞具有抗革兰阴性菌感染的作用，也可能暗示BPI具有抗寄生虫感染的作用。

　　用RT PCR进行扩增是目前*常用的获取目的基因片段方法，分为一步法和二步法，我们采用二步法进行。引物包括内外两套，外引物扩增后再用内引物进行扩增，保证反应具有较高的特异性。实验中首先以为引物，反转录合成之cDNA**链为模板进行扩增，所得产物少且有非特异产物存在，结果不甚理想。后改用BPI引物P2合成cD再采用套式进行扩增，适当提高退火温度并延长延伸时间，结果获得了单一的BPI片段。间接免疫荧光技术是免疫学研究中广泛使用的一项技术，用特异性单克隆抗体与活细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，在此基础上建立的活细胞免疫荧光技术，由于活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 HL60是髓样白血病细胞系，为较幼稚细胞，具有向粒系或单核系分化的能力， RT PCR扩增出了单一的片段，免疫荧光检测显示荧光，表明含有采用RT PCR和活细胞免疫荧光检测技术，我们发现HL60和PM N均扩增出了BPI基因片段，免疫荧光染色均呈阳性，表明BPI只存在于中性粒系细胞。 BPI的产生严格限于中性粒系细胞内，这一特性既反映出这种抗菌蛋白严格的靶细胞特异性，又显示了中性粒细胞在宿主抗革兰阴性菌感染方面起着重要的作用。

　　编辑王小仲肢端型系统性硬皮病误诊1例乔振军1，黄裕新2，王景杰佳县人民医院消化科，陕第四军医大学唐都医院消化科）中图号： R593. 25文献标识码： B 1病例报告女， 45岁，因吞咽困难16 mo伴发热15 d，于19990712入院。于16 mo前与人争吵后出现吞咽困难，以进食馒头、面条为著，剑突下有时出现梗噎感，随即呕吐，呕出所进食物及粘液，情绪波动可诱发症状加重，伴食欲减退、返酸。 15 d前无诱因出现不规则发热， T 38～39℃，上腹痛加重，全身酸困不适，乏力、头晕、消瘦。追问病史，患者5 a前双手、足疼痛麻木，尤以受凉、精神刺激后明显，手指初发白，继而发紫，变红，且麻木疼痛加重，手足小关节渐僵硬、畸形。曾到多家医院就诊，诊断：雷诺病、类风湿性关节炎。 2 a前出现脱发，面部、手足背部皮肤紧张。查体： T 39. 7℃。消瘦，面部表情固定，脱发，头皮、面部、手足背部皮肤紧张，呈腊样光泽，不能用手捏起，心肺（　） .剑突下压痛（ 6 ） .手足关节僵直畸形。胸部、腰椎双手X线拍片：无异常改变。胃镜检查：食管炎、浅表性胃炎。 ECG：房室传导阻滞，右心室肥厚。

　　 1， LE细胞未找到。诊断：肢端型系统性硬皮病。治疗1 mo后好转出院。

　　2讨论硬皮病是一种较常见的结缔组织病。系统型中，平滑肌包括肌组织的肌纤维束呈均一性、硬化和萎缩。肌纤维束间结缔组织增生，小血管壁增厚，管腔缩小或闭塞。食管受累相当常见（ 45～90 ） ，主要表现吞咽困难，其次为心血管、呼吸、泌尿以及神经精神系统，尚可有雷诺氏现象，手指关节畸形，不规则发热、乏力等。局限型受累范围相对局限，进展缓慢预后较好。本例初表现为手足麻木疼痛、畸形，僵直而误诊为雷诺氏病、类风湿性关节炎。当出现吞咽困难、呕吐等症状时又误为食管病变，时间长达5 a之久。本例并非疑难病，如果当时做一个全面的分析，明确诊断并非难事，只说明我们临床医师思维较局限，只注重专科病的诊治，而被表面现象所迷惑，以及对专科以外的专业知识忽视。

　　编辑王小仲

(完)